導(dǎo)讀
非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的慢性肝病之一，被認(rèn)為與飲食和腸道菌群失調(diào)有關(guān)。三氯蔗糖是一種有機(jī)氯人工甜味劑，它被越來越多地添加到日常食用的食品中，如軟飲料、谷類食品和無糖甜點(diǎn)。然而，越來越多的證據(jù)表明，過量的三氯蔗糖可引起腸道菌群失調(diào)，對(duì)宿主健康產(chǎn)生不利影響。而母體的飲食決定了新生兒的微生物群落，這種影響在子代的生活中還會(huì)繼續(xù)。本研究旨在探討母體攝入三氯蔗糖（maternal sucralose，MS）對(duì)子代成年期肝脂肪變性易感性的影響。
點(diǎn)擊文末“閱讀原文”，可轉(zhuǎn)至文獻(xiàn)下載頁(yè)面
文獻(xiàn)ID
英文題目：Maternal sucralose intake alters gut microbiota of offspring and exacerbateshepatic steatosis in adulthood
中文題目：母體攝入三氯蔗糖會(huì)改變子代腸道菌群，并加劇成年期肝脂肪變性
發(fā)表期刊：《Gut Microbes》IF：7.823
發(fā)表時(shí)間：2020/3/31
通訊作者：王邦茂、曹海龍
通訊單位：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
材料與方法
將C57BL/6孕鼠隨機(jī)分為MS組（妊娠期和哺乳期攝入MS）和母系對(duì)照組（MC組）。斷奶后，所有的幼仔在8周齡之前都以標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，然后用高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)4周。對(duì)3周齡的幼鼠進(jìn)行腸道發(fā)育、粘膜屏障功能和腸道菌群的檢測(cè)。此外，在第12周評(píng)估肝脂肪變性的嚴(yán)重程度、血清生化、脂質(zhì)代謝和腸道微生物組成等。
圖1a 實(shí)驗(yàn)流程圖
研究成果
1、MS抑制3周齡幼鼠的腸道發(fā)育，破壞腸道屏障
在本研究中，幼鼠的性別比例和總產(chǎn)仔數(shù)在MS組和MC組之間沒有顯著差異，且兩組均未發(fā)現(xiàn)死亡。除MS組子代在2~4周齡時(shí)體重明顯高于MC組外，其余8周齡測(cè)定時(shí)間點(diǎn)兩組子代體重基本一致。但在HFD 15天后，MS組子代體重明顯高于MC組。因此，補(bǔ)充MS可輕微增加斷奶期子代體重，顯著加重HFD幼鼠的體重（圖1b）。
在小鼠出生后第三周之前，胃腸道的發(fā)育主要受母體營(yíng)養(yǎng)的影響。本文研究了三氯蔗糖對(duì)3周齡幼鼠腸道發(fā)育和腸道屏障完整性的影響。MS組3周齡幼鼠的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度明顯小于MC組（圖1c-d）。與MC組比較，MS組Ki67陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)減少（圖2a）。同時(shí)，高碘酸希夫（PAS）陽(yáng)性細(xì)胞（杯狀細(xì)胞）數(shù)量也減少（圖2b）。MUC2是杯狀細(xì)胞最重要的產(chǎn)物之一，與黏液層的形成密切相關(guān)。根據(jù)MUC2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和mRNA的表達(dá)，與MC組相比，MUC2的表達(dá)量下調(diào)（圖2c-d）。緊密連接蛋白包括ZO-1、Claudin-1、Claudin-3和Occludin被認(rèn)為是決定腸道屏障完整性的最重要因素。PCR數(shù)據(jù)顯示，MS組Claudin-1、Claudin-3、ZO-1表達(dá)明顯降低，Occludin表達(dá)與MS組相似（圖3a）。此外，免疫熒光也提示MS組中ZO-1蛋白表達(dá)下降（圖3b）。免疫球蛋白A（IgA）在腸道免疫屏障功能中起著關(guān)鍵作用，可以抑制病原體的粘附。IgA免疫熒光顯示，MS可顯著降低IgA在小腸的表達(dá)水平（圖3c-d），提示MS可抑制幼鼠早期腸道發(fā)育，破壞腸道屏障的完整性。
通過HE染色發(fā)現(xiàn)，兩組幼鼠小腸和結(jié)腸沒有明顯的炎癥反應(yīng)（圖1c）。進(jìn)一步評(píng)估促炎細(xì)胞因子的水平，包括IL-1β，IFN-γ和結(jié)腸組織TNF-α。發(fā)現(xiàn)MS 組中這些促炎細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)水平明顯高于MC組（圖2e）。結(jié)果表明，攝入MS可引起子代腸道輕度炎癥，損傷腸道屏障功能。
圖1b-d 母鼠攝入三氯蔗糖抑制了3周齡幼鼠的腸道發(fā)育
圖2 母鼠攝入三氯蔗糖擾亂幼鼠腸道增殖和分化，并誘發(fā)3周齡幼鼠結(jié)腸輕度炎癥
圖3 母鼠攝入三氯蔗糖破壞幼鼠結(jié)腸的緊密連接，并使3周齡幼鼠小腸IgA減少
2、MS改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成
通過16s rRNA測(cè)序?qū)?周齡子代腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。Venn圖顯示，MC組共356個(gè)OTU，MS組共281個(gè)OTU，兩組共同擁有268個(gè)OTU（圖4a）。分析兩組的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，門水平優(yōu)勢(shì)物種分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。MS組疣微菌門和變形菌門的相對(duì)豐度隨著擬桿菌門的減少而升高。在屬水平，MS組與MC組之間存在顯著差異的屬主要有：Akkermansia、Alistipes、Barnesiella、Blautia、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、Paraprevotella、Robinsoniella、Saccharibacteria_genera_inc-ertaesedis、鏈球菌屬（Streptococcus）。與MC相比，MS組 Akkermansia、Blautia、棒狀桿菌屬和Robinsoniella顯著增加；同時(shí)，Alistipes、Barnesiella、Paraprevotella、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis和鏈球菌屬減少（圖4b）。
通過Shannon和Simpson多樣性指數(shù)評(píng)估3周齡幼鼠的微生物alpha多樣性。MS顯著降低了alpha多樣性（圖4c）。通過主坐標(biāo)（PCoA）分析和Adonis檢驗(yàn)對(duì)非加權(quán) UniFrac 距離進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算兩組樣本間的差異。結(jié)果表明，MS對(duì)3周齡幼鼠的微生物組成有顯著影響（圖4d）。
圖4 母體攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠腸道微生物組成
通過LEFSe差異分析兩組細(xì)菌在門、綱、目、科、屬水平上的豐度差異（圖5a）。差異物種豐度熱圖如圖5b所示。其中MS組抗炎相關(guān)的Alistipes相對(duì)豐度較低。Parabacteroides（一種能調(diào)節(jié)宿主代謝、減輕肥胖和代謝功能障礙的菌屬），在MS組中顯著降低。而與肥胖和代謝紊亂高度相關(guān)的Blautia在MS組中顯著升高。此外，在MS組中，疣微菌門的Akkermansia（一種降解黏液的菌）相對(duì)豐度增加，這可能是由于3周齡子代黏膜屏障功能的破壞和炎癥反應(yīng)的增加。與MS組腸道輕度炎癥增加相一致，埃希氏桿菌屬（Escherichia）/志賀氏桿菌（Shigella）和Anaerostipes在炎癥性腸病和代謝紊亂中更為豐富的菌，在MS組中增加。鏈球菌和瘤胃球菌在MS組中減少，以往的研究中發(fā)現(xiàn)，這兩種菌與炎癥呈負(fù)相關(guān)。此外， MS 組產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌Saccharibacteria_genera_incertae_sedis，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）和Clostridium XlVa顯著減少。這些結(jié)果表明，在孕期和哺乳期攝入MS可擾亂子代的腸道微生物組成。
圖5 母鼠攝入三氯蔗糖改變了3周齡幼鼠體內(nèi)關(guān)鍵細(xì)菌和SCFAs的產(chǎn)生
3、MS降低了3周齡幼鼠盲腸內(nèi)短鏈脂肪酸(SCFAs)含量
碳水化合物細(xì)菌發(fā)酵可產(chǎn)生醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等腸道SCFAs。已有研究報(bào)道腸道屏障功能與腸道SCFAs濃度呈正相關(guān)。在本研究中，MS組的丁酸鹽產(chǎn)量明顯低于MC組，乙酸和丙酸鹽產(chǎn)量也有下降的趨勢(shì)（圖5c）。上述發(fā)現(xiàn)以及上述微生物組成的變化提示，產(chǎn)生SCFAs的細(xì)菌數(shù)量的減少和丁酸鹽產(chǎn)量的下降可能與MS攝入導(dǎo)致腸道發(fā)育的抑制和腸道屏障的破壞有關(guān)。
4、MS加重了HFD誘導(dǎo)的成年小鼠肝脂肪變性
越來越多的研究表明，早期腸道微生物失衡和慢性炎癥可能與成年期的不良后果有關(guān)。本文研究了早期攝入MS是否會(huì)增加成年期肝脂肪變性的風(fēng)險(xiǎn)。總的來說，MS組肝臟顏色為淡黃色，而MC組肝臟顏色為暗紅色（圖6a）。MS組肝臟及腹部脂肪組織重量較MC組明顯增加（圖6b）。與MC組相比，MS 組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶顯著增加 。此外，MS組血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明顯升高（圖6c）。
HE染色證實(shí)，兩組12周齡幼鼠均有明顯的脂肪肝。MS組脂肪變性較嚴(yán)重，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，出現(xiàn)部分片狀壞死。同時(shí)，MS組NAFLD活性評(píng)分(NAS)也顯著高于MC組（圖6d）。MS組肝臟的炎性細(xì)胞因子IL- 6和TNF-α等也升高（圖6e）。
與MC組相比，MS組Fasn、Acaca等脂肪酸合成基因表達(dá)水平升高，膽汁酸合成限制酶Cyp7a1基因被抑制，肝臟中調(diào)節(jié)膽汁酸合成的關(guān)鍵基因shp顯著上調(diào)（圖6f）。這些基因表達(dá)的改變提示了MS干擾脂肪酸和膽汁酸的生物合成和代謝。
圖6 母體攝入三氯蔗糖會(huì)加重12周齡幼鼠HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性
5、HFD加重了成年小鼠的菌群失調(diào)
本文重點(diǎn)研究了HFD 4周后，MS組和MC組腸道菌群變化。MS組共336個(gè)OTU, MC組共285個(gè)OTU，兩組共同擁有269個(gè)OTU（圖7a）。與HFD前相比，兩組中厚壁菌門和變形桿菌門的相對(duì)豐度均升高，而擬桿菌門的相對(duì)豐度均降低。然而HFD 9周后，MS組變形菌門的豐度比MC組下降得更明顯（圖7b）。
兩組間Shannon和Simpson多樣性指數(shù)（alpha多樣性）無顯著差異（圖7c）。在beta多樣性方面，Adonis分析顯示兩組之間存在顯著差異（圖7d）。基于未加權(quán)UniFrac距離的3周齡和12周齡子代的PCoA分析顯示，HFD確實(shí)部分稀釋了MS驅(qū)動(dòng)的腸道菌群的差異（圖7e）。總之，本文研究結(jié)果表明，HFD嚴(yán)重加劇了后代腸道菌群的失調(diào)。然而，即使在HFD 4周后，MS組的腸道菌群與MC組仍有部分差異。
圖7 母體攝入三氯蔗糖加重12周齡幼鼠腸道發(fā)育不良
6、MS使3周齡幼鼠的GPR43表達(dá)量降低
有報(bào)道稱，丁酸鹽可激活G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor, GPCRs)，包括在腸上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞上表達(dá)的GPR41、GPR43和GPR109A。這些GPCRs的激活似乎可以通過多種機(jī)制緩解NAFLD的進(jìn)展。通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)3周齡子代結(jié)腸中GPR41、GPR43和GPR109A的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在MS組和MC組中，GPR41、GPR43和GPR109A均在結(jié)腸組織中表達(dá)。然而，MS組結(jié)腸中GPR43的表達(dá)明顯低于MC組，并伴有產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌和丁酸鹽的減少（圖8a）。Real-time-PCR數(shù)據(jù)也顯示，3周齡子代結(jié)腸組織中GPR43的相對(duì)表達(dá)量較MC組下降（圖8b）。
7、丁酸梭菌通過體外激活GPR43降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生
與對(duì)照組相比，丁酸鹽和丁酸梭菌上清液刺激HCT116細(xì)胞后，GPR43 mRNA水平分別上調(diào)2.2倍和2.8倍，GPR109A mRNA水平分別上調(diào)2.9倍和2.1倍，但GPR41 mRNA表達(dá)無明顯變化。同時(shí)，丁酸梭菌上清液和丁酸鹽分別使TNF-α的表達(dá)下降26.3%和36.1%。此外，通過RNA干擾技術(shù)研究了丁酸梭菌的抗炎功能是否依賴于GPR43。沉默GPR43抑制了丁酸梭菌介導(dǎo)的TNF-α 表達(dá)量下調(diào)。在HCT8細(xì)胞中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖8c-g）。這些結(jié)果表明，丁酸梭菌通過激活GPR43具有抗炎作用。
圖8 丁酸梭菌通過激活GPR43降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生
研究結(jié)論
1
MS抑制3周齡幼鼠的腸道發(fā)育，破壞腸道屏障，導(dǎo)致腸道輕度炎癥。
2
MS對(duì)3周齡幼鼠腸道的微生物組成有顯著影響，且HFD可顯著加重成年小鼠的菌群失調(diào)。
3
MS干擾成年小鼠的脂肪代謝，加重了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性。
掃一掃，關(guān)注本公眾號(hào)！
腸菌與健康 microbiota health
帶你了解腸道菌群與健康的奧秘！
點(diǎn)擊下方“閱讀原文”
轉(zhuǎn)至文獻(xiàn)下載頁(yè)面